Hybribody 奈米抗體的篩選和驗證

目標:胞內抗原(內源性)

奈米抗體篩選-有兩種方案

1. 噬菌體展示技術

透過抗體噬菌體展示進行抗體篩選。在該技術中,每個重組 VHH 都在噬菌體表面表達。通過 3-4 輪篩選來增加抗原特異性克隆數量,並經過幾次洗滌步驟去除未結合的噬菌體。最後,將我們感興趣的 VHH 洗下、並藉由 phage 感染 E-coli 產生VHH。

2. 酵母菌雜交技術

◆ 另一個方案,首先透過抗體噬菌體展示進行抗體篩選 1輪後,通過Gap Repair的方法,將通過噬菌體展示找出的候選VHH ( 結合GAL4轉錄活化域 ) 克隆入酵母菌獵物載體; 將Ag克隆( 結合DNA結合) 到酵母菌誘餌載體中。

◆ 兩單倍酵母菌,在缺乏組氨酸的選擇性培養基上進行交配,產生二倍體酵母。

◆ 如果VHH抗體片段能夠結合抗原,則發生功能性轉錄因子的重組和隨後His3報告基因的激活,使酵母菌可以生長,我們稱為陽性克隆positive clone。
◆ 對來自陽性克隆的cDNA進行測序和分析,以確定每種抗體的身份,接著透過螢光顯微鏡對Ab表達和Ag識別進行驗證。

奈米抗體篩選 - 驗證分析

噬菌體 ELISA 技術

Hybrigenics 的抗體經過嚴格的質量控制步驟以進行驗證。適當折疊的抗原可以選擇識別天然蛋白和具有挑戰性構象表位的抗體。利用ELISA技術,將抗原和抗體進行inqubation (抗原不直接貼附beads,可呈現真實懸浮狀態情況),再以M13二級抗體結合,以呈色或酵素方式定量。

螢光共定位分析 Immunofluorescence

我們為研究人員特別針對內源性的抗原,抗體驗證會以invivo在活細胞中進行,分別將目標抗原和VHH抗體接上螢光蛋白,轉染送入細胞中,和兩者有無co-localization,來證明VHH有辨識到目標抗原。

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