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miRNA 抑制體
產品特點：
1、有效的抑制內源性成熟miRNA功能
2、21-23 nt 2'-甲氧修飾的RNA寡核酸設計
3、較低的濃度就能高效長久的抑制miRNA活性
4、GMR-miRTM microRNA Inhibitors 是單鏈的化學修飾的增強型寡核苷酸對sanger miRNA 數據庫:http://microrna.sanger.ac.uk中所有人、小鼠以及大鼠miRNA有效
產品應用：
1、microRNA inhibitors抑制活體microRNA活性來研究Loss-of-function效應
2、篩選調控基因表達和影響細胞發育過程的miRNAs
3、深入研究miRNA在一些生物過程中的作用，如細胞的發育、增殖、分化和凋亡
4、發現和驗證內源性的miRNA target
功能介紹與實驗實例
一、設計miRNA序列
miR-21 inhibitors 實驗序列設計，常規Anti-miR-21設計（2'OMe）如下:
As-miR-21: 5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3'
NC：5'-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'
NC-FAM：5'- FAM-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'
全鏈2'-O-Me修飾。
二、實驗方案
1. 細胞培養
293T，A549
7* 10cm dish細胞
Lipofectamin 2000：250ul
Ezol：50ml
Hairpin-it miR-21 qPCR kit (300runs)：1個
2. 轉染效率條件
(1).細胞接種於24孔板，轉染Inhibitor-NC FAM優化轉染試劑與inhibitor的濃度配制比例，轉染4-6h，螢光顯微鏡觀察轉染效率，確定最佳轉染條件：
1. Inhibitor：25nM Lipo：1ul
2. Inhibitor：25nM Lipo：2ul
3. Inhibitor：50nM Lipo：1ul
4. Inhibitor：50nM Lipo：2ul
5. Inhibitor：100nM Lipo：1ul
6. Inhibitor：100nM Lipo：2ul
(2).miRNA inhibitor轉染
inhibitor 3個濃度梯度：25nM，50nM，100nM；NC選擇100nM轉染。
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protocal
miRNA 抑制體使用方法
MicroRNA Inhibitor介紹
MicroRNA Inhibitor是用來抑制內源性的MicroRNA的功能。特異的MicroRNA inhibitor能夠被導入到表達特異的microRNA的細胞內，抑制MicroRNA的作用，也可以用來抑製表達特異的內源性的miRNA的報告載體的表達。
抑制特異性的內源性的miRNA
為了分析miRNA對生物過程和內源性的靶的作用效果，miRNA inhibitor 能夠被轉染入細胞評估此效應能否被逆轉。
轉染程序
轉染效率對不同的細胞株和不同的轉染試劑是不同的。我們建議miRNA inhibitor 的終濃度為15-100nM
最優化的轉染濃度最終還是需要通過試驗來確定。我們發現典型的試驗中最佳的濃度範圍是15-100nM，但是優化的濃度範圍我們設定在1-100nM之間。
A：轉染試劑的推薦量，根據您訂購的試劑不同應做適當的調整
B：所顯示的添加量是miRNA inhibitor終濃度為30nM的量。由於最大miRNA inhibitor活性的量在不同的細胞類型是有差異的，所以推薦您自行優化。
C：對細胞密度只是推薦值，不同的細胞株有一定的變化，主要看細胞的大小和生長的狀況，一般來說我們推薦細胞融合度在30-70％為佳。
優化轉染效率是使得miRNA inhibitor 活性最大化的的最關鍵的一個因素之一，對每種轉染試劑而言，首先要確定一款最合適的轉染試劑，主要看從以下幾點著手處理：
1、轉染試劑的量
2、MicroRNA inhibitor的量
3、轉染時的細胞密度
4、轉染時候的操作順序
5、細胞與轉染試劑/siRNA複合物的接觸時間
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使用本產品發表的文獻
廠牌: Genpharma 產品:miRNA
1.Chen S, Sun YY, Zhang ZX, Li YH, Xu ZM, Fu WN. Transcriptional suppression of microRNA-27a contributes to laryngeal cancer differentiation via GSK-3β-involved Wnt/β-catenin pathway.Oncotarget. 2017 Feb 28; 8(9): 14708-18.
2.Kong LY, Xue M, Zhang QC, Su CF. In vivo and in vitro effects of microRNA-27a on proliferation, migration and invasion of breast cancer cells through targeting of SFRP1 gene via Wnt/β-catenin signaling pathway. Oncotarget. 2017 Feb; 8(9): 15507-19.
3.Kong X, Liu F, Gao J. MiR-155 promotes epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma cells through the activation of PI3K/SGK3/β-catenin signaling pathways. Oncotarget. 2016 Oct 4; 7(40): 66051-60.
4.Li X, Liang Q, Zhang W, Li Y, Ye J, Zhao F, Chen X, Wang S. Bio-inspired bioactive glasses for efficient microRNA and drug delivery. Journal of Materials Chemistry B. 2017 Jul.
5.Ren Y, Chen Y, Liang X, Lu Y, Pan W, Yang M. MiRNA-638 promotes autophagy and malignant phenotypes of cancer cells via directly suppressing DACT3. Cancer Letters. 2017 Apr 1; 390: 126-36.
6.Sun Y, Xu J, Xu L, Zhang J, Chan K, Pan X, Li G. MiR-503 Promotes Bone Formation in Distraction Osteogenesis through Suppressing Smurf1 Expression.Scientific Reports. 2017 Mar; 7: 409.
7.Xue X, Qiu Y, Yang HL. Immunoregulatory Role of MicroRNA-21 in Macrophages in Response to Bacillus Calmette-Guerin Infection Involves Modulation of the TLR4/MyD88 Signaling Pathway.Cellular Physiology and Biochemistry. 2017 May 12; 42(1): 91-102.
8.Yu F, Guo Y, Chen B, Shi L, Dong P, Zhou M, Zheng J. LincRNA-p21 Inhibits the Wnt/β-Catenin Pathway in Activated Hepatic Stellate Cells via Sponging MicroRNA-17-5p.Cellular Physiology and Biochemistry. 2017 Jun; 41(5): 1970-80.
9.Zhou Z, Wan J, Hou X, Geng J, Li X, Bai X. MicroRNA-27a promotes podocyte injury via PPARγ-mediated β-catenin activation in diabetic nephropathy. Cell death & disease. 2017 Mar; 8(3): e2658.
10.Zeng Z, Wang K, Li Y, Xia N, Nie S, Lv B, Zhang M, Tu X, Li Q, Tang T, Cheng X. Down-regulation of microRNA-451a facilitates the activation and proliferation of CD4+ T cells by targeting Myc in patients with dilated cardiomyopathy. Journal of Biological Chemistry. 2017 Apr 7; 292(14): 6004-13.
mimic
miRNA 模擬體
我們為客戶提供不同長度、不同形式的microRNA mimics，microRNA序列來自sanger miRNA數據庫（http://microrna.sanger.ac.uk/sequences）
您可利用microRNA mimics模擬活體microRNA活性來研究gain-of-function效應，篩選調控基因表達和影響細胞發育過程的miRNAs，深入研究miRNA在一些生物過程中的作用，如細胞的發育、增殖、分化和凋亡，發現和驗證內源性的miRNA target。
產品介紹與使用方法
本範例產品： microRNA mimics
貨號： B01001
規格： 2 OD
PAGE檢測： 產品是準確分子量大小且經過特殊化學分子修飾的雙鏈mimics分子。
HPLC純化： 經過HPLC純化並測定miRNA mimics,純度>95%
注意事項： RNA oligo在操作過程中，如果有外源的核酸酶存在，RNA oligo容易發生降解。在進行相關實驗中，請帶手套進行操作，盡量避免RNAase污染，試管，移液槍和槍頭都要避免污染。收到產品後儘快儲存在-20℃或-80℃環境中。
產品形式: 乾粉
儲存條件： 在-20℃或者-80℃條件下長期存放
收到MicroRNA mimics 產品後處理步驟：
1、在最大轉速為4,000g的低速條件下離心EP管，讓miRNA mimics 聚集在試管的底部。
2、輕輕的打開管蓋。
3、1OD加入DEPC水125ul,配成20uM的儲存液。
4、柔和地用移液槍吹打儲備液5-6次。
5、根據實際用量情況分裝，避免多次凍融。
6、在重新儲存的時候注意密封好EP管。
7、貯存在-80℃,以備使用。
miRNA mimics 是根據microRNA 成熟體序列設計的雙鏈小RNA分子，用於模擬內源性成熟體miRNA序列。mimics包括一條與目標miRNA成熟體序列一致的序列，以及一條與miRNA成熟體序列互補的序列。特異的miRNA mimics 能夠被導入到表達對應的miRNA細胞中，模擬microRNA的作用，或者與構建有miRNA結合位點的雙熒光素報告系統結合，驗證miRNA與靶基因之間的調控關係。
靶基因表達水平分析
通過對轉染miRNA mimics 和陰性對照序列的細胞內mRNA靶基因進行即時定量螢光PCR檢測和western Blotting 檢測，可以檢測靶基因蛋白的表達水平，驗證miRNA與靶基因之間的調控關係。
miRNA3'UTR靶位點驗證分析
通過將一個或多個預測的miRNA3'UTR結合靶位點構建到報告載體上，並將miRNA mimics 和報告載體共轉染細胞，mimics可以抑制報告載體上的報告基因，從而可以直接檢驗mimics和miRNA預測結合位點之間的作用關係。我們建議使用miRNA mimics 陰性對照作為參照，陰性對照的實驗濃度，轉染條件與實驗組相同。
轉染程序
轉染效率對不同的細胞株和不同的轉染試劑是不同的。
最優的轉染條件還是需要通過實驗來確定。我們建議優化時的miRNA mimics的濃度範圍可以放寬至1-100nM之間。
(上圖)轉染試劑的建議量，但仍須根據您訂購的試劑不同應做適當的調整。
(上圖)所顯示的添加量是miRNA mimics 終濃度為30nM的量。由於最大miRNA mimics 活性的量在不同細胞類型是有差異的，所以推薦您自行優化。
(上圖)對細胞密度只是建議值，不同的細胞株有一定的變化，主要看細胞的大小和生長情況，一般我們推薦的細胞融合度在30-70%為佳。
轉染條件優化：
優化轉染效率是使得miRNA mimics活性最大化的關鍵因素之一，對每種轉染試劑而言，首先要確定一款合適的轉染試劑，主要看從以下幾點
1、轉染試劑的量
2、miRNA agomir的量
3、轉染時的細胞密度
4、轉染時的操作順序
5、細胞與轉染試劑/siRNA複合物的接觸時間
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