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標準siRNA oligo
標準siRNA oligo均由HPLC純化，價格便宜，質量好客戶回購率高。
客戶可自己提供序列，也可委託我們幫忙設計序列，每個基因我們會設計四個靶點的siRNA。可單買一條或購買套餐組合。
本公司提供的siRNA產品是直接作用於靶基因mRNA，因此我們建議您在收到產品後先進行即時定量PCR，以確定靶基因mRNA表達值，接著就可直接確認合成或構建的siRNA產品是否有效抑制。
購買前請留意：我們的產品保證序列合成和訂單要求一致，保證質量和純度達到要求，但因抑制實驗變數很多，我們無法為您保證抑制效果，非產品序列或純度之產品質量問題，皆無法退費。
所有產品僅限用於實驗研究用途，非使用於人體。
功能介紹與實驗實例
siRNA Real-Time PCR結果分析
對於RNAi實驗而言，我們通常需要知道的是某一特定細胞在導入siRNA前後某一特定基因的表達變化情況來判斷siRNA的作用。應用螢光定量PCR的方法，可以通過兩種途徑來判斷，一是測定特定細胞在導入siRNA前後某一特定基因mRNA數量的變化，即為絕對定量；二是通過檢測特定基因與某一管家基因在在導入siRNA前後相對表達值的變化，即為相對定量。比較常使用的是採用相對定量的方法來檢測siRNA的Gene Knockdown作用。
1．Real-Time PCR 實驗設計
Real-Time PCR實驗設計時應包括實驗組（導入siRNA），陰性對照（Negative Control）和Mock Transfaction三組。每組至少三個重複。各組同時檢測目標基因和管家基因的Ct值。下例中以GAPDH為管家基因。
2．Real-Time PCR得到siRNA導入前後目標基因和管家基因的Ct值
各組重複實驗的Ct值差異不能過大；一般地，重複實驗Ct值差異在1以內是可以接受的。
3．Real-Time PCR數據分析
以Mock Tansfection為對照（Calibrator），管家基因為Normalizer，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組－( Ct目的基因- Ct管家基因)對照
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標準siRNA Oligo使用方法
A．標準siRNA轉染的方法
哺乳動物轉染的常見方法有：磷酸鈣共沉澱、電穿孔法、DEAE-葡聚醣和polybrene、機械法（例如,顯微注射和基因槍）、陽離子脂質體試劑，其中陽離子脂質體試劑轉染法是目前最常用的轉染方法。
應用脂質體型轉染試劑進行轉染需要注重的幾個方面：轉染試劑的用量、siRNA的用量、轉染時的細胞密度、轉染時的操作順序、細胞與轉染試劑/siRNA複合物的溫浴的時間
B．Lipofectamin2000 轉染試劑
選擇最適合的轉染試劑和轉染條件，往往取決於不同的哺乳動物細胞類型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000適用於核酸的體內和體外操作，可應用於DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA的轉染，也可應用於DNA/siRNA的共轉染操作；是一種新型的高效siRNA轉染試劑。
Lipofectamin2000的應用領域：
1、原代培養細胞和轉化細胞株的基因轉染
2、siRNA高通量轉染試驗
3、DNA轉染；DNA和siRNA的共轉染
4、核酸（siRNA、DNA、RNA）的體內導入試驗
5、貼壁細胞和懸浮細胞轉染
Lipofectamin2000 的特點：
1、不必更換培養基，操作簡便易行，可在半小時內完成操作
2、在含血清培養基中也能表現高轉染效率
3、細胞毒性低；適用細胞廣泛
4、即用型試劑，可在含有抗生素的完全培養基中轉染
5、基於脂質的轉染試劑，確保沒有RNAse活性
6、可介導siRNA高轉染細胞及in vivo siRNA的高效導入
C. Lipofectamin2000適用的細胞類型
Lipofectamin2000轉染試劑可廣泛應用於多種細胞系的DNA和siRNA轉染如：HeLa(人頸部癌細胞)、MCF-7(人乳房癌細胞)、Hep3B(人肝細胞癌細胞)、COS-7(猴腎細胞)、Neuro-2a(鼠神經母細胞瘤細胞)、NIKS(人角質化細胞)、B16(鼠黑素瘤細胞)、DLD-1(人結腸癌細胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纖維細胞)、HT-29(人結腸腺癌細胞)、A549(人肺癌細胞)、CHO-k1(倉鼠卵巢細胞)和293(腺病毒5 DNA轉化的人胚胎腎細胞),SVRbag4細胞等。
D．轉染前細胞培養
在培養細胞時，應使細胞在24小時內達到70-90%。
E．合適的lipofectamin2000用量
合適的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例對核酸的高效轉染有重要影響；我們推薦的DNA：lipofetamin2000為1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000為1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情況下，此範圍內都可獲得高的轉染效率。
F．貼壁細胞轉染程序
選用生理狀態良好的細胞對提高轉染效率很重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和兩者的比例可在推薦範圍內適當調整。
1、轉染前一天，4-5´104細胞接種在24孔板上， 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培養基）細胞培養基。
2、選擇用於初期接種的細胞數量，應能在24小時內使細胞達到70-90%。
3、在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養基）無血清培養基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻；
4、混勻lipofectamin試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養基）稀釋1μl lipofectamin試劑（DNA轉染時，則加入2μllipofectamin試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘；
5、將稀釋好的siRNA和RNAi-Mate試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）複合物。
6、將100μl siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）複合物加到含有細胞和培養基的培養板的孔中，來回輕柔搖晃細胞培養板板。
7、 細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h後，進行轉染後的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感，孵育4-6小時後，除去複合物，更換培養基。
G．懸浮細胞轉染程序
1、轉染的當天，收集細胞離心，用含FBS的培養基重懸。
2、在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他無血清培養基）無血清的培養基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混勻；
3、混勻lipofectamin試劑，用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM，或其他無血清培養基）稀釋1μl lipofectamin試劑（DNA轉染時，則加入2μl lipofectamin試劑），輕輕混勻，室溫放置5分鐘；
4、將稀釋好的siRNA和lipofectamin試劑混合；輕柔混勻，室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）複合物。
5、再加入400μL細胞懸浮液（細胞數量決定於細胞類型和轉染後分析測試的時間）。
6、細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h後，進行轉染後的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感，孵育4-6小時後，除去複合物，更換培養基。
H．DNA和siRNA共轉染細胞
1、在轉染的前一天，4-5´104細胞接種在24孔板上，0.5 mL含FBS和抗生素的細胞培養基。
2、選擇用於初期接種的細胞密度，應能在24小時內使細胞匯合達到70-90%。
3、在100μL的無血清的培養基中稀釋20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl lipofectamin試劑，充分混合，放置20分鐘,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin複合物。
4、將siRNA/ DNA/lipofectamin複合物加入培養基中，輕輕混勻。
5、細胞在37℃溫育24h-48h後，進行轉染後的其它步驟。
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廠牌: Genpharma 產品:siRNA
螢光標記siRNA oligo
我們可對siRNA末端用多種螢光標記物進行標記。標記後的siRNA可用流式細胞儀、螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等觀察到，確定轉染效率，優化轉染條件;標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追踪轉染過程中導入了siRNA的細胞。
我們可對siRNA末端用多種螢光標記物進行標記，反義鏈5'端標記會影響其抑制反應，所以不推薦在這一位點進行標記，在其他三個末端修飾對抑制反應影響很小。我們推薦在正義鏈的5'端修飾，目前公認這是最佳的化學標記位點。
siRNA標記的螢光基團染料大體上有3類：6-羧基螢光素染料，花青素染料和羅丹明染料，種類詳述如下。
螢光素染料修飾：
5'-Fluorescein CE Phosphoramidite (6-Fam)，顏色：Green/yellow。
5'-Tetrachloro-Fluorescein CE Phosphoramidite (TET)，顏色：Orange/yellow。
5'-Hexachloro-Fluorescein CE Phosphoramidite (HEX)，顏色：Pink。
FAM/TET/HEX 是最常用的螢光染料,化學合成簡單，收率高，能夠幫助優化各種細胞的轉染條件，跟踪RNA在細胞或者動物的位置分佈。螢光的最佳工作PH值範圍在7.5~8.3 ，FAM/TET/HEX標記的Oligo要避光，乾粉，-20℃貯存。
花青素染料修飾：
Quasar570 CE Phosphoramidite (Cy3)，顏色：Dark pink。
Quasar670 CE Phosphoramidite (Cy5)，顏色：Blue。
我們是以Quasar染料代替Cy染料修飾，屬花青素染料類，深粉紅色，它們的吸收波長和激發波長相似. Quasar染料比CY類標計的Oligo要更穩定。具有穩定的螢光，能夠幫助優化各種細胞的轉染條件，追踪RNA在細胞或者動物的位置分佈。
羅丹明染料修飾：
CAL Fluor Red 610 CE phosphoramidite, 顏色：Orange/red。
TAMRA，顏色：Red。
CAL Fluor Red 610可以作為Texas Red（德克薩斯紅）或ROX dyes的替代物與BHQ-2配合使用。TAMRA 既可做發光基團又可做猝滅基團，由於TAMRA發射光譜比較寬，一般用作淬滅基團。
各種螢光染料的激發波長和吸收波長見下表：
使用方法
一、螢光標記的siRNA
轉染效率的高低可以通過螢光標記的siRNA（FAM-siRNA）判讀。
FAM-siRNA 轉染細胞後，可以用螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等檢測，確定是否有效轉染和優化轉染條件。FAM-siRNA 還可用作siRNA 胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追踪轉染過程中導入了siRNA 的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。
二、使用螢光標記的siRNA（FAM-siRNA）檢測轉染效率
1 FAM-siRNA的溶解及保存
（1）由於OligoRNA產品容易輕附在管壁上，打開時極易散失，所以打開離心管前先離心，然後再慢慢打開管蓋，溶解時加適量DEPC水後蓋上管蓋，振盪溶解。
（2）需要濃度20uM的樣品，如何計算重懸siRNA緩衝液的量？你購買了1OD的siRNA，想溶解為20uM 的樣品，應該使用150ul附送的DEPC水去重懸1OD的siRNA,溶解後為20uM的樣品。
（3）貯存和穩定性：-20℃，避光保存，凍乾粉或液體。液體（貯存濃度為20μM）避免反覆凍融，保證在上述條件下siRNA oligo的穩定性可達到6個月。
2 轉染
使用lipofectamin2000 轉染的步驟（以貼壁細胞為例，僅供參考）
（1）以24孔培養板操作為例（其他孔板各種的試劑用量，請參照“Lipofectamine2000 manual”），轉染前一天，將0.5~2X105個細胞接種於培養盤中，每孔中加入約500ul無抗生素的培養基，使轉染時的細胞密度能夠達到30～50％；
（2）取1μl/孔Lipofectamine2000（使用前輕輕搖勻），用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋。輕輕混和後在室溫孵育5 min；
（3）取2ul FAM-siRNA，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀釋，輕輕混和均勻;
（4）稀釋的Lipofectamine2000（2）經過5min 的孵育後，與稀釋FAM-siRNA（3）輕輕混和，室溫靜置20min，以形成FAM-siRNA-轉染試劑混和物，如果溶液出現渾濁，屬於正常現象，不會影響轉染效果。
注意：稀釋的Lipofectamine2000（2）盡量在25min 之內，和稀釋的FAM-siRNA 混和，如果放置時間過長，可能導致轉染試劑活性的降低;
（5）將FAM-siRNA-轉染試劑混和液（4）加入含有細胞及培養液（約含400ul）的孔中，輕輕搖晃孔板，使混和；
（6）在37 ℃的CO2 培養箱中培養，4-6 小時後可將培養基換為含血清的完全培養基(該步驟可以省略);
（7）轉染6小時後即可檢測轉染效率：流式細胞儀、螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等（見後面）。
轉染操作注意事項：
（1）FAM-siRNA 的轉染過程和普通siRNA 是一樣的，注意整個實驗過程要盡量避光，建議轉染時室內和操作台內不要開燈；
（2）保持FAM-siRNA 管外有錫紙包裹，在靜置lipo-siRNA 過程中盡量避光，
（3）轉染操作盡量快，操作時間盡量短，操作完畢請盡快將培養板放到培養箱。
（4）一般來說，使用Lipofectamine 2000 作為轉染試劑，4～6 小時就可以保證siRNA 轉染進入細胞。因此轉染效率的檢測可以在轉染後6小時（轉染過程完成）進行。
3、觀察與檢測
檢測方法：螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀
螢光顯微鏡觀察注意事項（流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡檢測請參照儀器說明書）：
（1）FAM 是一種綠色螢光基團，由藍光激發，激發波長480nm，發射波長520nm。
（2）使用Lipofectamine 2000 轉染後6 小時就可以檢測，檢測前細胞處理等操作都必須避光！對於檢測的時間要求相對不是特別嚴格，成功轉染的細胞如果沒有受到強光刺激的話，螢光一般不會消失，我們建議盡量在轉染後24 小時內完成檢測。
（3）確保熟悉螢光顯微鏡操作。建議檢測時，可以先使光路先對準沒有轉染FAM -siRNA的孔，調好焦距打開激發光，一切準備就緒後再進行觀察（一般情況下可以馬上看到螢光）。
（4）觀察時間不宜過長，盡量避免螢光被猝滅，光路對準轉染孔，馬上觀察和拍照。拍完螢光照片後，最好在同一視野中拍下明場的細胞照片。
（5）只有成功轉染的細胞才能看到FAM 綠色螢光，與綠色螢光蛋白GFP 的螢光不太一樣，FAM 的螢光比較弱，散在分佈在細胞質中。
（6）由於螢光容易猝滅，應用計數的方法計算轉染效率效果不好，最好用流式細胞儀檢測。
（7）如果您對我們FAM-siRNA 質量有任何質疑的話，您可以從中吸取少量（2～5μl）FAM-siRNA，加在載玻片上，蓋上蓋玻片，直接於螢光顯微鏡下觀察。注意保證FAM-siRNA 的保存和使用方法無誤，另外，所有操作都必須在避光條件下進行。
Fluo
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