標準siRNA oligo

標準siRNA oligo均由HPLC純化,價格便宜,質量好客戶回購率高。

客戶可自己提供序列,也可委託我們幫忙設計序列,每個基因我們會設計四個靶點的siRNA。可單買一條或購買套餐組合。

本公司提供的siRNA產品是直接作用於靶基因mRNA,因此我們建議您在收到產品後先進行即時定量PCR,以確定靶基因mRNA表達值,接著就可直接確認合成或構建的siRNA產品是否有效抑制。

購買前請留意:我們的產品保證序列合成和訂單要求一致,保證質量和純度達到要求,但因抑制實驗變數很多,我們無法為您保證抑制效果,非產品序列或純度之產品質量問題,皆無法退費。

所有產品僅限用於實驗研究用途,非使用於人體。

功能介紹與實驗實例

siRNA Real-Time PCR結果分析

對於RNAi實驗而言,我們通常需要知道的是某一特定細胞在導入siRNA前後某一特定基因的表達變化情況來判斷siRNA的作用。應用螢光定量PCR的方法,可以通過兩種途徑來判斷,一是測定特定細胞在導入siRNA前後某一特定基因mRNA數量的變化,即為絕對定量;二是通過檢測特定基因與某一管家基因在在導入siRNA前後相對表達值的變化,即為相對定量。比較常使用的是採用相對定量的方法來檢測siRNA的Gene Knockdown作用。

1.Real-Time PCR 實驗設計

Real-Time PCR實驗設計時應包括實驗組(導入siRNA),陰性對照(Negative Control)和Mock Transfaction三組。每組至少三個重複。各組同時檢測目標基因和管家基因的Ct值。下例中以GAPDH為管家基因。















2.Real-Time PCR得到siRNA導入前後目標基因和管家基因的Ct值

各組重複實驗的Ct值差異不能過大;一般地,重複實驗Ct值差異在1以內是可以接受的。









3.Real-Time PCR數據分析

以Mock Tansfection為對照(Calibrator),管家基因為Normalizer,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-( Ct目的基因- Ct管家基因)對照


 
3siRNA.JPG
Ct(1).JPG
Ct(2).JPG
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標準siRNA Oligo使用方法

A.標準siRNA轉染的方法

哺乳動物轉染的常見方法有:磷酸鈣共沉澱、電穿孔法、DEAE-葡聚醣和polybrene、機械法(例如,顯微注射和基因槍)、陽離子脂質體試劑,其中陽離子脂質體試劑轉染法是目前最常用的轉染方法。

應用脂質體型轉染試劑進行轉染需要注重的幾個方面:轉染試劑的用量、siRNA的用量、轉染時的細胞密度、轉染時的操作順序、細胞與轉染試劑/siRNA複合物的溫浴的時間


B.Lipofectamin2000 轉染試劑

選擇最適合的轉染試劑和轉染條件,往往取決於不同的哺乳動物細胞類型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000適用於核酸的體內和體外操作,可應用於DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA的轉染,也可應用於DNA/siRNA的共轉染操作;是一種新型的高效siRNA轉染試劑。


Lipofectamin2000的應用領域:

1、原代培養細胞和轉化細胞株的基因轉染
2、siRNA高通量轉染試驗
3、DNA轉染;DNA和siRNA的共轉染
4、核酸(siRNA、DNA、RNA)的體內導入試驗
5、貼壁細胞和懸浮細胞轉染


Lipofectamin2000 的特點: 

1、不必更換培養基,操作簡便易行,可在半小時內完成操作
2、在含血清培養基中也能表現高轉染效率
3、細胞毒性低;適用細胞廣泛
4、即用型試劑,可在含有抗生素的完全培養基中轉染
5、基於脂質的轉染試劑,確保沒有RNAse活性
6、可介導siRNA高轉染細胞及in vivo siRNA的高效導入


C. Lipofectamin2000適用的細胞類型

Lipofectamin2000轉染試劑可廣泛應用於多種細胞系的DNA和siRNA轉染如:HeLa(人頸部癌細胞)、MCF-7(人乳房癌細胞)、Hep3B(人肝細胞癌細胞)、COS-7(猴腎細胞)、Neuro-2a(鼠神經母細胞瘤細胞)、NIKS(人角質化細胞)、B16(鼠黑素瘤細胞)、DLD-1(人結腸癌細胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纖維細胞)、HT-29(人結腸腺癌細胞)、A549(人肺癌細胞)、CHO-k1(倉鼠卵巢細胞)和293(腺病毒5 DNA轉化的人胚胎腎細胞),SVRbag4細胞等。


D.轉染前細胞培養

在培養細胞時,應使細胞在24小時內達到70-90%。


E.合適的lipofectamin2000用量

合適的siRNA(DNA):lipofetamin2000比例對核酸的高效轉染有重要影響;我們推薦的DNA:lipofetamin2000為1:0.5—1:5(ug:ul),siRNA:lipofectamin2000為1:0.01-1:0.1(pmol:ul)一般情況下,此範圍內都可獲得高的轉染效率。



F.貼壁細胞轉染程序

選用生理狀態良好的細胞對提高轉染效率很重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和兩者的比例可在推薦範圍內適當調整。

1、轉染前一天,4-5´104細胞接種在24孔板上, 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM(或Opti-MEM,其他培養基)細胞培養基。
2、選擇用於初期接種的細胞數量,應能在24小時內使細胞達到70-90%。
3、在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他無血清培養基)無血清培養基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混勻;
4、混勻lipofectamin試劑,用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM,或其他無血清培養基)稀釋1μl lipofectamin試劑(DNA轉染時,則加入2μllipofectamin試劑),輕輕混勻,室溫放置5分鐘;

5、將稀釋好的siRNA和RNAi-Mate試劑混合;輕柔混勻,室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)複合物。
6、將100μl siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)複合物加到含有細胞和培養基的培養板的孔中,來回輕柔搖晃細胞培養板板。
7、 細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h後,進行轉染後的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感,孵育4-6小時後,除去複合物,更換培養基。  


G.懸浮細胞轉染程序

1、轉染的當天,收集細胞離心,用含FBS的培養基重懸。
2、在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他無血清培養基)無血清的培養基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混勻;
3、混勻lipofectamin試劑,用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM,或其他無血清培養基)稀釋1μl lipofectamin試劑(DNA轉染時,則加入2μl lipofectamin試劑),輕輕混勻,室溫放置5分鐘;
4、將稀釋好的siRNA和lipofectamin試劑混合;輕柔混勻,室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)複合物。
5、再加入400μL細胞懸浮液(細胞數量決定於細胞類型和轉染後分析測試的時間)。
6、細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h後,進行轉染後的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感,孵育4-6小時後,除去複合物,更換培養基。  



H.DNA和siRNA共轉染細胞

1、在轉染的前一天,4-5´104細胞接種在24孔板上,0.5 mL含FBS和抗生素的細胞培養基。
2、選擇用於初期接種的細胞密度,應能在24小時內使細胞匯合達到70-90%。
3、在100μL的無血清的培養基中稀釋20pmol siRNA和0.2μg DNA,加入2μl lipofectamin試劑,充分混合,放置20分鐘,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin複合物。
4、將siRNA/ DNA/lipofectamin複合物加入培養基中,輕輕混勻。
5、細胞在37℃溫育24h-48h後,進行轉染後的其它步驟。




 

​使用本產品發表的文獻

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18.Zhang R, Guo H, Xu J, Li B, Liu YJ, Cheng C, Zhou C, Zhao Y, Liu Y. Activated platelets inhibit hepatocellular carcinoma cell differentiation and promote tumor progression via platelet-tumor cell binding. Oncotarget. 2016 Sep; 7(37): 60609-22.

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20.Tan J, Yang L, Liu C, Yan Z. MicroRNA-26a targets MAPK6 to inhibit smooth muscle cell proliferation and vein graft neointimal hyperplasia. Scientific Reports. 2017 Apr; 7: 46602. a>Scientific Reports. 2017 Mat; 7: 43485.





 

廠牌: Genpharma   產品:siRNA

螢光標記siRNA oligo

我們可對siRNA末端用多種螢光標記物進行標記。標記後的siRNA可用流式細胞儀、螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等觀察到,確定轉染效率,優化轉染條件;標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追踪轉染過程中導入了siRNA的細胞。

我們可對siRNA末端用多種螢光標記物進行標記,反義鏈5'端標記會影響其抑制反應,所以不推薦在這一位點進行標記,在其他三個末端修飾對抑制反應影響很小。我們推薦在正義鏈的5'端修飾,目前公認這是最佳的化學標記位點。

siRNA標記的螢光基團染料大體上有3類:6-羧基螢光素染料,花青素染料和羅丹明染料,種類詳述如下。

螢光素染料修飾:

5'-Fluorescein CE Phosphoramidite (6-Fam),顏色:Green/yellow。

5'-Tetrachloro-Fluorescein CE Phosphoramidite (TET),顏色:Orange/yellow。 

5'-Hexachloro-Fluorescein CE Phosphoramidite (HEX),顏色:Pink。

FAM/TET/HEX 是最常用的螢光染料,化學合成簡單,收率高,能夠幫助優化各種細胞的轉染條件,跟踪RNA在細胞或者動物的位置分佈。螢光的最佳工作PH值範圍在7.5~8.3 ,FAM/TET/HEX標記的Oligo要避光,乾粉,-20
貯存。

花青素染料修飾:

Quasar570 CE Phosphoramidite (Cy3),顏色:Dark pink。

Quasar670 CE Phosphoramidite (Cy5),顏色:Blue。

我們是以Quasar染料代替Cy染料修飾,屬花青素染料類,深粉紅色,它們的吸收波長和激發波長相似. Quasar染料比CY類標計的Oligo要更穩定。具有穩定的螢光,能夠幫助優化各種細胞的轉染條件,追踪RNA在細胞或者動物的位置分佈。

羅丹明染料修飾:

CAL Fluor Red 610 CE phosphoramidite, 顏色:Orange/red。

TAMRA,顏色:Red。

CAL Fluor Red 610可以作為Texas Red(德克薩斯紅)或ROX dyes的替代物與BHQ-2配合使用。TAMRA 既可做發光基團又可做猝滅基團,由於TAMRA發射光譜比較寬,一般用作淬滅基團。

各種螢光染料的激發波長和吸收波長見下表:
Fluo.JPG

使用方法

一、螢光標記的siRNA

轉染效率的高低可以通過螢光標記的siRNA(FAM-siRNA)判讀。 
FAM-siRNA 轉染細胞後,可以用螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等檢測,確定是否有效轉染和優化轉染條件。FAM-siRNA 還可用作siRNA 胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追踪轉染過程中導入了siRNA 的細胞,將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。 

二、使用螢光標記的siRNA(FAM-siRNA)檢測轉染效率 

1 FAM-siRNA的溶解及保存 
(1)由於OligoRNA產品容易輕附在管壁上,打開時極易散失,所以打開離心管前先離心,然後再慢慢打開管蓋,溶解時加適量DEPC水後蓋上管蓋,振盪溶解。 
(2)需要濃度20uM的樣品,如何計算重懸siRNA緩衝液的量?你購買了1OD的siRNA,想溶解為20uM 的樣品,應該使用150ul附送的DEPC水去重懸1OD的siRNA,溶解後為20uM的樣品。 
(3)貯存和穩定性:-20℃,避光保存,凍乾粉或液體。液體(貯存濃度為20μM)避免反覆凍融,保證在上述條件下siRNA oligo的穩定性可達到6個月。 

2 轉染 
使用lipofectamin2000 轉染的步驟(以貼壁細胞為例,僅供參考) 
(1)以24孔培養板操作為例(其他孔板各種的試劑用量,請參照“Lipofectamine2000 manual”),轉染前一天,將0.5~2X105個細胞接種於培養盤中,每孔中加入約500ul無抗生素的培養基,使轉染時的細胞密度能夠達到30~50%; 
(2)取1μl/孔Lipofectamine2000(使用前輕輕搖勻),用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋。輕輕混和後在室溫孵育5 min; 
(3)取2ul FAM-siRNA,用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀釋,輕輕混和均勻;
(4)稀釋的Lipofectamine2000(2)經過5min 的孵育後,與稀釋FAM-siRNA(3)輕輕混和,室溫靜置20min,以形成FAM-siRNA-轉染試劑混和物,如果溶液出現渾濁,屬於正常現象,不會影響轉染效果。 
注意:稀釋的Lipofectamine2000(2)盡量在25min 之內,和稀釋的FAM-siRNA 混和,如果放置時間過長,可能導致轉染試劑活性的降低;
(5)將FAM-siRNA-轉染試劑混和液(4)加入含有細胞及培養液(約含400ul)的孔中,輕輕搖晃孔板,使混和; 
(6)在37 ℃的CO2 培養箱中培養,4-6 小時後可將培養基換為含血清的完全培養基(該步驟可以省略);
(7)轉染6小時後即可檢測轉染效率:流式細胞儀、螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等(見後面)。 

轉染操作注意事項: 

(1)FAM-siRNA 的轉染過程和普通siRNA 是一樣的,注意整個實驗過程要盡量避光,建議轉染時室內和操作台內不要開燈; 
(2)保持FAM-siRNA 管外有錫紙包裹,在靜置lipo-siRNA 過程中盡量避光, 
(3)轉染操作盡量快,操作時間盡量短,操作完畢請盡快將培養板放到培養箱。 
(4)一般來說,使用Lipofectamine 2000 作為轉染試劑,4~6 小時就可以保證siRNA 轉染進入細胞。因此轉染效率的檢測可以在轉染後6小時(轉染過程完成)進行。

3、觀察與檢測 

檢測方法:螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀 
螢光顯微鏡觀察注意事項(流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡檢測請參照儀器說明書): 
(1)FAM 是一種綠色螢光基團,由藍光激發,激發波長480nm,發射波長520nm。 
(2)使用Lipofectamine 2000 轉染後6 小時就可以檢測,檢測前細胞處理等操作都必須避光!對於檢測的時間要求相對不是特別嚴格,成功轉染的細胞如果沒有受到強光刺激的話,螢光一般不會消失,我們建議盡量在轉染後24 小時內完成檢測。 
(3)確保熟悉螢光顯微鏡操作。建議檢測時,可以先使光路先對準沒有轉染FAM -siRNA的孔,調好焦距打開激發光,一切準備就緒後再進行觀察(一般情況下可以馬上看到螢光)。 
(4)觀察時間不宜過長,盡量避免螢光被猝滅,光路對準轉染孔,馬上觀察和拍照。拍完螢光照片後,最好在同一視野中拍下明場的細胞照片。 
(5)只有成功轉染的細胞才能看到FAM 綠色螢光,與綠色螢光蛋白GFP 的螢光不太一樣,FAM 的螢光比較弱,散在分佈在細胞質中。 
(6)由於螢光容易猝滅,應用計數的方法計算轉染效率效果不好,最好用流式細胞儀檢測。 
(7)如果您對我們FAM-siRNA 質量有任何質疑的話,您可以從中吸取少量(2~5μl)FAM-siRNA,加在載玻片上,蓋上蓋玻片,直接於螢光顯微鏡下觀察。注意保證FAM-siRNA 的保存和使用方法無誤,另外,所有操作都必須在避光條件下進行。