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標準siRNA oligo
標準siRNA oligo均由HPLC純化,價格便宜,質量好客戶回購率高。
客戶可自己提供序列,也可委託我們幫忙設計序列,每個基因我們會設計四個靶點的siRNA。可單買一條或購買套餐組合。
本公司提供的siRNA產品是直接作用於靶基因mRNA,因此我們建議您在收到產品後先進行即時定量PCR,以確定靶基因mRNA表達值,接著就可直接確認合成或構建的siRNA產品是否有效抑制。
購買前請留意:我們的產品保證序列合成和訂單要求一致,保證質量和純度達到要求,但因抑制實驗變數很多,我們無法為您保證抑制效果,非產品序列或純度之產品質量問題,皆無法退費。
所有產品僅限用於實驗研究用途,非使用於人體。
功能介紹與實驗實例
siRNA Real-Time PCR結果分析
對於RNAi實驗而言,我們通常需要知道的是某一特定細胞在導入siRNA前後某一特定基因的表達變化情況來判斷siRNA的作用。應用螢光定量PCR的方法,可以通過兩種途徑來判斷,一是測定特定細胞在導入siRNA前後某一特定基因mRNA數量的變化,即為絕對定量;二是通過檢測特定基因與某一管家基因在在導入siRNA前後相對表達值的變化,即為相對定量。比較常使用的是採用相對定量的方法來檢測siRNA的Gene Knockdown作用。
1.Real-Time PCR 實驗設計
Real-Time PCR實驗設計時應包括實驗組(導入siRNA),陰性對照(Negative Control)和Mock Transfaction三組。每組至少三個重複。各組同時檢測目標基因和管家基因的Ct值。下例中以GAPDH為管家基因。
2.Real-Time PCR得到siRNA導入前後目標基因和管家基因的Ct值
各組重複實驗的Ct值差異不能過大;一般地,重複實驗Ct值差異在1以內是可以接受的。
3.Real-Time PCR數據分析
以Mock Tansfection為對照(Calibrator),管家基因為Normalizer,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-( Ct目的基因- Ct管家基因)對照
protocal
標準siRNA Oligo使用方法
A.標準siRNA轉染的方法
哺乳動物轉染的常見方法有:磷酸鈣共沉澱、電穿孔法、DEAE-葡聚醣和polybrene、機械法(例如,顯微注射和基因槍)、陽離子脂質體試劑,其中陽離子脂質體試劑轉染法是目前最常用的轉染方法。
應用脂質體型轉染試劑進行轉染需要注重的幾個方面:轉染試劑的用量、siRNA的用量、轉染時的細胞密度、轉染時的操作順序、細胞與轉染試劑/siRNA複合物的溫浴的時間
B.Lipofectamin2000 轉染試劑
選擇最適合的轉染試劑和轉染條件,往往取決於不同的哺乳動物細胞類型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000適用於核酸的體內和體外操作,可應用於DNA、RNA、反義寡核苷酸、siRNA的轉染,也可應用於DNA/siRNA的共轉染操作;是一種新型的高效siRNA轉染試劑。
Lipofectamin2000的應用領域:
1、原代培養細胞和轉化細胞株的基因轉染
2、siRNA高通量轉染試驗
3、DNA轉染;DNA和siRNA的共轉染
4、核酸(siRNA、DNA、RNA)的體內導入試驗
5、貼壁細胞和懸浮細胞轉染
Lipofectamin2000 的特點:
1、不必更換培養基,操作簡便易行,可在半小時內完成操作
2、在含血清培養基中也能表現高轉染效率
3、細胞毒性低;適用細胞廣泛
4、即用型試劑,可在含有抗生素的完全培養基中轉染
5、基於脂質的轉染試劑,確保沒有RNAse活性
6、可介導siRNA高轉染細胞及in vivo siRNA的高效導入
C. Lipofectamin2000適用的細胞類型
Lipofectamin2000轉染試劑可廣泛應用於多種細胞系的DNA和siRNA轉染如:HeLa(人頸部癌細胞)、MCF-7(人乳房癌細胞)、Hep3B(人肝細胞癌細胞)、COS-7(猴腎細胞)、Neuro-2a(鼠神經母細胞瘤細胞)、NIKS(人角質化細胞)、B16(鼠黑素瘤細胞)、DLD-1(人結腸癌細胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纖維細胞)、HT-29(人結腸腺癌細胞)、A549(人肺癌細胞)、CHO-k1(倉鼠卵巢細胞)和293(腺病毒5 DNA轉化的人胚胎腎細胞),SVRbag4細胞等。
D.轉染前細胞培養
在培養細胞時,應使細胞在24小時內達到70-90%。
E.合適的lipofectamin2000用量
合適的siRNA(DNA):lipofetamin2000比例對核酸的高效轉染有重要影響;我們推薦的DNA:lipofetamin2000為1:0.5—1:5(ug:ul),siRNA:lipofectamin2000為1:0.01-1:0.1(pmol:ul)一般情況下,此範圍內都可獲得高的轉染效率。
F.貼壁細胞轉染程序
選用生理狀態良好的細胞對提高轉染效率很重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和兩者的比例可在推薦範圍內適當調整。
1、轉染前一天,4-5´104細胞接種在24孔板上, 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM(或Opti-MEM,其他培養基)細胞培養基。
2、選擇用於初期接種的細胞數量,應能在24小時內使細胞達到70-90%。
3、在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他無血清培養基)無血清培養基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混勻;
4、混勻lipofectamin試劑,用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM,或其他無血清培養基)稀釋1μl lipofectamin試劑(DNA轉染時,則加入2μllipofectamin試劑),輕輕混勻,室溫放置5分鐘;
5、將稀釋好的siRNA和RNAi-Mate試劑混合;輕柔混勻,室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)複合物。
6、將100μl siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)複合物加到含有細胞和培養基的培養板的孔中,來回輕柔搖晃細胞培養板板。
7、 細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h後,進行轉染後的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感,孵育4-6小時後,除去複合物,更換培養基。
G.懸浮細胞轉染程序
1、轉染的當天,收集細胞離心,用含FBS的培養基重懸。
2、在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他無血清培養基)無血清的培養基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混勻;
3、混勻lipofectamin試劑,用50μl無血清的DMEM或Opti-MEM,或其他無血清培養基)稀釋1μl lipofectamin試劑(DNA轉染時,則加入2μl lipofectamin試劑),輕輕混勻,室溫放置5分鐘;
4、將稀釋好的siRNA和lipofectamin試劑混合;輕柔混勻,室溫放置20分鐘,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)複合物。
5、再加入400μL細胞懸浮液(細胞數量決定於細胞類型和轉染後分析測試的時間)。
6、細胞在CO2培養箱中37℃溫育24h-48h後,進行轉染後的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感,孵育4-6小時後,除去複合物,更換培養基。
H.DNA和siRNA共轉染細胞
1、在轉染的前一天,4-5´104細胞接種在24孔板上,0.5 mL含FBS和抗生素的細胞培養基。
2、選擇用於初期接種的細胞密度,應能在24小時內使細胞匯合達到70-90%。
3、在100μL的無血清的培養基中稀釋20pmol siRNA和0.2μg DNA,加入2μl lipofectamin試劑,充分混合,放置20分鐘,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin複合物。
4、將siRNA/ DNA/lipofectamin複合物加入培養基中,輕輕混勻。
5、細胞在37℃溫育24h-48h後,進行轉染後的其它步驟。
使用本產品發表的文獻
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廠牌: Genpharma 產品:siRNA
螢光標記siRNA oligo
我們可對siRNA末端用多種螢光標記物進行標記。標記後的siRNA可用流式細胞儀、螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等觀察到,確定轉染效率,優化轉染條件;標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追踪轉染過程中導入了siRNA的細胞。
我們可對siRNA末端用多種螢光標記物進行標記,反義鏈5'端標記會影響其抑制反應,所以不推薦在這一位點進行標記,在其他三個末端修飾對抑制反應影響很小。我們推薦在正義鏈的5'端修飾,目前公認這是最佳的化學標記位點。
siRNA標記的螢光基團染料大體上有3類:6-羧基螢光素染料,花青素染料和羅丹明染料,種類詳述如下。
螢光素染料修飾:
5'-Fluorescein CE Phosphoramidite (6-Fam),顏色:Green/yellow。
5'-Tetrachloro-Fluorescein CE Phosphoramidite (TET),顏色:Orange/yellow。
5'-Hexachloro-Fluorescein CE Phosphoramidite (HEX),顏色:Pink。
FAM/TET/HEX 是最常用的螢光染料,化學合成簡單,收率高,能夠幫助優化各種細胞的轉染條件,跟踪RNA在細胞或者動物的位置分佈。螢光的最佳工作PH值範圍在7.5~8.3 ,FAM/TET/HEX標記的Oligo要避光,乾粉,-20℃貯存。
花青素染料修飾:
Quasar570 CE Phosphoramidite (Cy3),顏色:Dark pink。
Quasar670 CE Phosphoramidite (Cy5),顏色:Blue。
我們是以Quasar染料代替Cy染料修飾,屬花青素染料類,深粉紅色,它們的吸收波長和激發波長相似. Quasar染料比CY類標計的Oligo要更穩定。具有穩定的螢光,能夠幫助優化各種細胞的轉染條件,追踪RNA在細胞或者動物的位置分佈。
羅丹明染料修飾:
CAL Fluor Red 610 CE phosphoramidite, 顏色:Orange/red。
TAMRA,顏色:Red。
CAL Fluor Red 610可以作為Texas Red(德克薩斯紅)或ROX dyes的替代物與BHQ-2配合使用。TAMRA 既可做發光基團又可做猝滅基團,由於TAMRA發射光譜比較寬,一般用作淬滅基團。
各種螢光染料的激發波長和吸收波長見下表:
使用方法
一、螢光標記的siRNA
轉染效率的高低可以通過螢光標記的siRNA(FAM-siRNA)判讀。
FAM-siRNA 轉染細胞後,可以用螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等檢測,確定是否有效轉染和優化轉染條件。FAM-siRNA 還可用作siRNA 胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追踪轉染過程中導入了siRNA 的細胞,將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。
二、使用螢光標記的siRNA(FAM-siRNA)檢測轉染效率
1 FAM-siRNA的溶解及保存
(1)由於OligoRNA產品容易輕附在管壁上,打開時極易散失,所以打開離心管前先離心,然後再慢慢打開管蓋,溶解時加適量DEPC水後蓋上管蓋,振盪溶解。
(2)需要濃度20uM的樣品,如何計算重懸siRNA緩衝液的量?你購買了1OD的siRNA,想溶解為20uM 的樣品,應該使用150ul附送的DEPC水去重懸1OD的siRNA,溶解後為20uM的樣品。
(3)貯存和穩定性:-20℃,避光保存,凍乾粉或液體。液體(貯存濃度為20μM)避免反覆凍融,保證在上述條件下siRNA oligo的穩定性可達到6個月。
2 轉染
使用lipofectamin2000 轉染的步驟(以貼壁細胞為例,僅供參考)
(1)以24孔培養板操作為例(其他孔板各種的試劑用量,請參照“Lipofectamine2000 manual”),轉染前一天,將0.5~2X105個細胞接種於培養盤中,每孔中加入約500ul無抗生素的培養基,使轉染時的細胞密度能夠達到30~50%;
(2)取1μl/孔Lipofectamine2000(使用前輕輕搖勻),用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋。輕輕混和後在室溫孵育5 min;
(3)取2ul FAM-siRNA,用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀釋,輕輕混和均勻;
(4)稀釋的Lipofectamine2000(2)經過5min 的孵育後,與稀釋FAM-siRNA(3)輕輕混和,室溫靜置20min,以形成FAM-siRNA-轉染試劑混和物,如果溶液出現渾濁,屬於正常現象,不會影響轉染效果。
注意:稀釋的Lipofectamine2000(2)盡量在25min 之內,和稀釋的FAM-siRNA 混和,如果放置時間過長,可能導致轉染試劑活性的降低;
(5)將FAM-siRNA-轉染試劑混和液(4)加入含有細胞及培養液(約含400ul)的孔中,輕輕搖晃孔板,使混和;
(6)在37 ℃的CO2 培養箱中培養,4-6 小時後可將培養基換為含血清的完全培養基(該步驟可以省略);
(7)轉染6小時後即可檢測轉染效率:流式細胞儀、螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等(見後面)。
轉染操作注意事項:
(1)FAM-siRNA 的轉染過程和普通siRNA 是一樣的,注意整個實驗過程要盡量避光,建議轉染時室內和操作台內不要開燈;
(2)保持FAM-siRNA 管外有錫紙包裹,在靜置lipo-siRNA 過程中盡量避光,
(3)轉染操作盡量快,操作時間盡量短,操作完畢請盡快將培養板放到培養箱。
(4)一般來說,使用Lipofectamine 2000 作為轉染試劑,4~6 小時就可以保證siRNA 轉染進入細胞。因此轉染效率的檢測可以在轉染後6小時(轉染過程完成)進行。
3、觀察與檢測
檢測方法:螢光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀
螢光顯微鏡觀察注意事項(流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡檢測請參照儀器說明書):
(1)FAM 是一種綠色螢光基團,由藍光激發,激發波長480nm,發射波長520nm。
(2)使用Lipofectamine 2000 轉染後6 小時就可以檢測,檢測前細胞處理等操作都必須避光!對於檢測的時間要求相對不是特別嚴格,成功轉染的細胞如果沒有受到強光刺激的話,螢光一般不會消失,我們建議盡量在轉染後24 小時內完成檢測。
(3)確保熟悉螢光顯微鏡操作。建議檢測時,可以先使光路先對準沒有轉染FAM -siRNA的孔,調好焦距打開激發光,一切準備就緒後再進行觀察(一般情況下可以馬上看到螢光)。
(4)觀察時間不宜過長,盡量避免螢光被猝滅,光路對準轉染孔,馬上觀察和拍照。拍完螢光照片後,最好在同一視野中拍下明場的細胞照片。
(5)只有成功轉染的細胞才能看到FAM 綠色螢光,與綠色螢光蛋白GFP 的螢光不太一樣,FAM 的螢光比較弱,散在分佈在細胞質中。
(6)由於螢光容易猝滅,應用計數的方法計算轉染效率效果不好,最好用流式細胞儀檢測。
(7)如果您對我們FAM-siRNA 質量有任何質疑的話,您可以從中吸取少量(2~5μl)FAM-siRNA,加在載玻片上,蓋上蓋玻片,直接於螢光顯微鏡下觀察。注意保證FAM-siRNA 的保存和使用方法無誤,另外,所有操作都必須在避光條件下進行。
Fluo
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