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標準shRNA Plasmid

shRNA plasmid表達載體帶有抗生素標記，可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數十天。對於一個已知有效的siRNA序列（例如，經過siRNA合成方法篩選獲得的），需要維持較長時間的基因沉默時，推薦使用shRNA載體系統。

我們的shRNA表達載體系統特點：

1、克隆載體具有兩種形式的克隆酶切位點BbsⅠ和BamHⅠ。 BbsⅠ是特殊的限制性內切酶，產生非對稱互補粘性末端，保證插入片斷的方向正確，防止載體自體連接。

2、shRNA多種篩選標記可幫助建立穩定轉染細胞，包括有Neo ：Neomycin耐受基因、Hygro ：Hygromycin B 耐受基因、GFP/RFP：GFP報告基因或RFP報告基因，報告基因GFP/RFP可以幫助判定轉染效率和指示RNAi發生位點

本公司共可構建11種RNAi Vector，分別為pGPU6, pGPH1, pGPU6/Neo, pGPH1/Neo, pGPU6/Hygro, pGPH1/Hygro, pGPU6/GFP/Neo, pGPH1/GFP/Neo，pGPU6/RFP/Neo, pGPH1/RFP/Neo,pGPU6/mCherry/Puro。其中pGPU6, pGPH1為無篩選標記RNAi載體；pGPU6/Neo, pGPH1/Neo, pGPU6/Hygro, pGPH1/Hygro為含抗性篩選標記Neomycin和Hygromycin的RNAi載體；
pGPU6/GFP/Neo, pGPH1/GFP/Neo分別為含抗性篩選標記Neomycin同時可以表達GFP蛋白的RNAi載體；
pGPU6/RFP/Neo, pGPH1/RFP/Neo分別為含抗性篩選標記Neomycin同時可以表達RFP蛋白的RNAi載體。

我們可以幫您將編碼目標shRNA 的DNA插入質體，並做序列正確性檢測，您只需告訴我們靶基因序列或Gene ID號和希望插入載體的名稱，我們來幫您構建。我們為您提供足夠使用的純化的編碼您的目的shRNA plasmid。

推薦您選擇shRNA套餐，shRNA套餐會幫您針對目的基因設計並製備4個shRNA載體,細胞轉染效率達到70%以上，確保4個shRNA中,至少一個,在mRNA水平的基因的抑制效率在70%以上.和必需的陰性對照以及一個好的GAPDH陽性對照載體。

 

功能介紹與實驗實例

細胞培養

人胚腎細胞293T，常規培養使用含10% FBS (Gibco)的DMEM培養基(Gibco)(含1.5 mM L-Glutamine, 3.7 g/L NaHCO3, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml Streptomycin)中，37ºC 5% CO2飽和濕度培養箱中培養。

寡核苷酸的設計

shRNA模板中的loop結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉錄終止序列採用T6結構。正義鏈模板的5'端添加了CACC，與BbsI酶切後形成的粘端互補；反義鏈模板的5'端添加了GATC，與BamHI酶切後形成的粘端互補；如果siRNA的第一個鹼基不是G，則在CACC後補加一個G。

Negative Control-S:
5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGT TTCAAGAGA ACGTGACACGTTCGGAGAA TTTTTT G-3'
Negative Control- AS:
5'-GATC CAAAAAA TTCTCCGAACGTGTCACGT TCTCTTGAA ACGTGACACGTTCGGAGAAC-3'





pGPU6/GFP/Neo-shRNA載體的構建簡介

1. 按照如下體系進行載體的連接反應：











2. 22℃ 反應1hr, 將連接產物轉化到感受態細胞中。
3. 每個連接反應挑取5個菌落，接種到含50 ug/ml Kanamycin的LB培養集中。
4. 使用鹼裂解法抽提質粒，所得質粒用BamH I, Pst I分別酶切鑑定。
5. 陽性重組載體送去定序。。


shRNAplasmid的轉染

人胚腎細胞293T（常規培養於6 cm培養皿中）
DMEM培養基+10% FBS
D-Hank's Solution
Trypsin-EDTA Solution (0.25% Trypsin +0.53 mM EDTA, Hyclone)
Lipofectamin2000轉染試劑（Invitrogen）
Opti-MEM I Reduced serum medium(Gibco)
無抗生素的DMEM培養基
12孔板（Corning）

步驟

1. 293T細胞在10 cm培養皿中培養至80-90%融合時，接種12孔板。
2. 傾去培養液，用5 ml D-Hank's solution洗滌細胞兩次。
3. 加入2 ml Trypsin-EDTA solution, 混勻後，37ºC放置3-5分鐘。
4. 小心吸去胰酶溶液，在加入2 ml 含10% FBS的DMEM培養液，吹打使細胞形成單細胞懸液。
5. 血球計數板計數，將細胞稀釋至5×105細胞/ml。
6. 按2.5×105細胞/孔的濃度接種12孔板，混勻後於37ºC 5% CO2培養24小時。
7. 在1.5 ml EP管中加入100 μl Opti-MEM I，再加入2μg質粒，取另一1.5mlEP管，加入100μl Opti-MEM I，加入4μl Lipofectamin2000，混勻，室溫放置5分鐘後將兩管混合，室溫放置20~30分鐘。
8. 吸去12孔板中的培養液，每孔加入800 μl無血清的DMEM培養液。
9. 將轉染混合物逐滴加入12孔板中，混勻後，在培養箱中溫育4-6小時。
10. 吸棄轉染液，加入1ml含10% FBS的DMEM培養液。37ºC 5% CO2繼續培養24-48小時。
11. 所得細胞用於RNA抽提並進行後續RT-PCR以及Western Blot檢測。

實驗結果與分析

細胞轉染結果

右圖為細胞轉染質粒後48小時的螢光照片，兩圖為同一視野。轉染效率在90%以上。

總RNA的質量檢測

轉染後24小時用Trizol法提取抽取細胞總RNA，所得RNA溶解於DEPC處理的ddH2O中。採用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整度，採用分光光度法測定RNA的濃度和純度。實驗中所得樣品的OD260/OD280的值均在1.8-2.0範圍之內，並根據OD260計算濃度，調整RNA的濃度為500 ng/μl；瓊脂糖凝膠電泳結果（圖2）表示，28S rRNA與18S rRNA的亮度比值約為2：1，說明實驗中所抽提得到的總RNA質量較好，無降解，可以滿足後續實驗的要求。
右圖總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結果（1×TAE）
轉染後24小時細胞RNA樣品1，GAPDH干擾組；2，NC；3，Mock；4，Blank

Real-time PCR法檢測RNA干擾效果

Western blot法檢測RNA干擾效果
shRNA(1).JPG
shRNA(2).JPG
shRNA(3).JPG
shRNA(4).JPG
protocal

標準shRNA plasmid使用方法

使用shRNA載體針對某一基因進行RNＡ干擾研究過程中，通常會遇到如下幾個問題：實驗對照組的確立、細胞轉染條件的確定、基因抑制效率的檢測。  
 
1、 實驗對照組的確立

在一個完善的RNA 干擾實驗設計中，必須考慮設立正確合理的實驗對照組。通常，這些對照組包括陰性對照、陽性對照、轉染試劑對照。

陰性對照可以有兩種，一種是採用通用的陰性對照組，可以表達與目的基因序列無同源性的siRNA 片段；另一種是將目的siRNA 的序列打亂後重新組合所得的陰性對照（scrambled）。

陽性對照組的設立對於RNA 干擾研究是很有必要的，尤其對於第一次接觸RNA 干擾的用戶而言。您可以利用陽性對照來確認RNAi 實驗中轉染和基因表達檢測方法的可靠性。陽性對照通常採用已驗證的對某些基因有效抑制的siRNA 片段。例如針對人類GAPDH 基因的表達載體（shGAPDH），該載體在導入細胞中後，可以有效抑制GAPDH 基因的表達。


2、 細胞轉染條件的確定

使用DNA 載體轉染細胞時，為了選擇合適的轉染方法和確定轉染效率，通常採用報告基因來檢測DNA 的導入情況。最常用的報告基因是綠色螢光蛋白。您可以先使用可以表達綠色螢光蛋白的表達載體來確定轉染效率和轉染條件，然後使用同樣的條件來轉染其他shRNA 表達載體。

還用一種方法可以用於確定轉染條件，就是採用陽性對照載體來轉染細胞（如shGAPDH），檢測對照載體對基因的抑制效率，然後採用抑制效率較高時的轉染條件來進一步轉染shRNA 表達載體。

RNA干擾實驗操作 

由於在RNA 干擾實驗中有多種條件選擇如試劑和細胞株等，在本實驗操作中以shNC 為陰性對照，shGAPDH 為陽性對照，RNAi-Mate 為轉染試劑，Hela 細胞為實驗細胞株，按照上述條件分步闡述RNA 干擾實驗的操作過程。如果您使用不同的細胞株和轉染試劑，可根據《RNAi 產品使用手冊》進行相應的調整。


1  轉染條件的確定

如果您所定購的載體中不含綠色螢光蛋白的表達框架，建議您可以先使用可以表達綠色螢光蛋白的表達載體來確定轉染效率和轉染條件，然後使用同樣的條件來轉染shRNA 表達載體。還用一種方法可以用於確定轉染條件，就是採用陽性對照載體來轉染細胞（如shGAPDH），檢測對照載體對基因的抑制效率，然後採用抑制效率較高時的轉染條件來進一步轉染shRNA 表達載體。 

1、轉染前一天，接種0.4-1.0×10 細胞/孔至24 孔板中，加入500μl 含血清培養液，37℃ 5% CO 2培養如果您選用可表達綠色螢光蛋白的pGPU6/GFP/Neo或pGPH1/GFP/Neo 載體，可以直接用這些載體來確定轉染效率；如果選用其他載體，可用其他表達綠色螢光蛋白的載體來確定轉染條件，或使用陽性對照載體如shGAPDH來去確定轉染條件。選用生理狀態良好的細胞對提高轉染效率很重要。DNA的用量及其與轉染試劑的比例可在推薦範圍內適當調整。

2、 在50 μl Opti-MEM I 培養液或其它無血清培養液中加入0.5-0.8μg DNA，混勻。

3、 使用前輕輕混勻RNAi-Mate 試劑，切忌離心處理。用30μl 無血清的DMEM 或Opti-MEM，或其他無血清培養基）稀釋1-4μg RNAi-Mate 試劑（可以分別設立DNA/RNAi-Mate 的不同用量組，通常DNA和RNAi-Mate 的用量在1：2-1：5 範圍內，針對不同的細胞需要不同的用量），輕輕混勻，室溫放置5 分鐘。

4、 將稀釋好的siRNA 和RNAi-Mate 試劑混合，定容到100μl；輕柔混勻，室溫放置30 分鐘，以便形成siRNA/RNAi-Mate（或DNA/RNAi-Mate）複合物。

5、 將100μl DNA/RNAi-Mate 複合物加到含有細胞和培養基的培養板的孔中，來回輕柔搖晃細胞培養板板，使DNA/RNAi-Mate 混合物均勻覆蓋細胞。

6、 細胞在CO2 培養箱中37℃溫育24h-48h 後，進行轉染後的其它檢測步驟。如果細胞株比較敏感，孵育 4-6 小時後，除去複合物，更換培養基。

7、 如果使用可以表達綠色螢光蛋白的DNA 載體來檢測細胞的轉染效率，細胞轉染後24-48 h 後，使用螢光顯微鏡觀察計數表達綠色螢光蛋白的細胞，在明場觀察計數同一視野中的總細胞數，轉染細胞率=螢光蛋白表達細胞數/總細胞數×100%。或使用DAPI 等染料染核後，使用流式細胞儀進行計數，然後計算轉染效率。

8、 也可使用陽性對照的抑制率來標定轉染效率。例如使用shGAPDH 來抑制細胞內GAPDH 基因的表達，如果轉染效率較高，shGAPDH 對GAPDH 基因的mRNA 和蛋白水平的抑制率通常分別為50-90%和50-90%。反之，如果shGAPDH 對GAPDH 基因表現出較高的抑制率，也表明細胞的轉染效率較高，可以滿足進一步實驗需要。

9、 如果在轉染條件摸索實驗中沒有找到較高效率的轉染方法，請更換轉染方法和試劑。如無其他方法選擇，可以使用流式細胞儀將轉染的細胞分選出來用於後續實驗。如果無法分選細胞，可以在計算RNA干擾抑制效率時去除轉染效率的影響，也可以使用抗生素對轉染後的細胞進行初篩後再進一步檢測抑制效率。

2  細胞的轉染

1、 設定合理的實驗組，包括轉染試劑對照（mock transfection）、陰性對照(negative control)、陽性對照（positive control）和目的基因實驗組。

2、 按照前面實驗確定的細胞接種量接種。37ºC 5% CO2 培養至40-70%融合。

3、 按照前面實驗確定的轉染條件轉染細胞。如果需要轉染不同培養量的細胞，試劑的用量可以根據本公司《RNAi 產品使用手冊》第9 頁和第13 頁所述進行相應的變化。

4、 轉染後24-48h 後，收集細胞進行下一步的檢測工作。通常，目的基因在轉染後24-48h 內就會表現出表達抑制，但有一些蛋白比如穩定性較強、半衰期較長的蛋白在轉染後含量降低比較緩慢，所以需要延長檢測時間。

3  基因抑制效率的檢測

1、 在本公司的《RNAi 產品使用手冊》 14 頁-19 頁中較詳細地介紹了使用螢光定量PCR 技術和Western blot 方法檢測目的基因表達變化的操作步驟和注意事項，可以酌情選用。

 

​使用本產品發表的文獻

1.Hui K, Gao Y, Huang J, Xu S, Wang B, Zeng J, Fan J, Wang X, Yue Y, Wu S, Hsieh JT, He D, Wu K. RASAL2, a RAS GTPase-activating protein, inhibits stemness and epithelial–mesenchymal transition via MAPK/SOX2 pathway in bladder cancer. Cell Death & Disease. 2017 Feb; 8(2): e2600.

2.Zhou C, Gu J, Zhang G, Dong D, Yang Q, Chen MB, Xu D. AMPK-autophagy inhibition sensitizes icaritin-induced anti-colorectal cancer cell activity. Oncotarget. 2017 Feb 28; 8(9): 14736-47. r. Cell Death & Disease. 2017 Feb; 8(2): e2600.

3.Zhang X, Liu N, Shao ZY, Qiu H, Yao H, Ji JY, Wang J, Lu W, Chen RC, Zhang L. Folate-targeted nanoparticle delivery of androgen receptor shRNA enhances the sensitivity of hormone-independent prostate cancer to radiotherapy. Nanomedicine- Nanotechnology, Biology and Medicine. 2017 May; 13(4): 1309-21.

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6.Liu W, Mao L, Ji F, Chen F, Hao Y, Liu G. Targeted activation of AMPK by GSK621 ameliorates H2O2-induced damages in osteoblasts.Oncotarget. 2017 Feb 2; 8(6): 10543-52. 

7.Liu N, Zhang L, Wang Z, Cheng Y, Zhang P, Wang X, Wen W, Yang H, Liu H, Jin W, Zhang Y, Tu Y. MicroRNA-101 inhibits proliferation, migration and invasion of human glioblastoma by targeting SOX9. Oncotarget. 2017 Mar 21; 8(12): 19244-54.

8.Li J, Wang F, Wang G, Sun Y, Cai J, Liu X, Zhang J, Lu X, Li Y, Chen M, Chen L, Jiang C. Combination epidermal growth factor receptor variant III peptide-pulsed dendritic cell vaccine with miR-326 results in enhanced killing on EGFRvIII-positive cells. Oncotarget. 2017 Apr 18; 8(16): 26256-68.

9.Cai H, Yao J, An Y, Chen X, Chen W, Wu D, Luo B, Yang Y, Jiang Y, Sun D, He X. LncRNA HOTAIR acts as competing endogenous RNA to control the expression of Notch3 via sponging miR-613 in pancreatic cancer. Oncotarget. 2017 May 16; 8(20): 32905-17. 8.

10.Chen M, Li J, Zhuang C, Cai Z. Increased lncRNA ABHD11-AS1 represses the malignant phenotypes of bladder cancer. Oncotarget. 2017 Apr 5; 8(17): 28176-86. cer. Oncotarget. 2017 May 16; 8(20): 32905-17. 8.

11.Gao HY, Huo FC, Wang HY, Pei DS. MicroRNA-9 inhibits the gastric cancer cell proliferation by targeting TNFAIP8. Cell Proliferation. 2017 Jan 27; 50(2). 

12.He Y, Li S, Zhang W, Dai W, Cui T, Wang G, Gao T, Li C. Dysregulated autophagy increased melanocyte sensitivity to H2O2-induced oxidative stress in vitiligo.Scientific Reports. 2017; 7: 42394.

13.Li Z, Wang X, Wang W, Du J, Wei J, Zhang Y, Wang J, Hou Y. Altered long non-coding RNA expression profile in rabbit atria with atrial fibrillation: TCONS_00075467 modulates atrial electrical remodeling by sponging miR-328 to regulate CACNA1C.Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2017 Jul; 108: 73-85. 

14.Xu R, Han M, Xu Y, Zhang X, Zhang C, Zhang D, Ji J, Wei Y, Wang S, Huang B, Chen A, Zhang Q, Li W, Sun T, Wang F, Li X, Wang J. Coiled-coil domain containing 109B is a HIF1α-regulated gene critical for progression of human gliomas. Journal of Translational Medicine. 2017 Jul 8; 15(1): 165.

15.Chen X, Dong H, Liu S, Yu L, Yan D, Yao X, Sun W, Han D, Gao G. Long noncoding RNA MHENCR promotes melanoma progression via regulating miR-425/489-mediated PI3K-Akt pathway.American Journal of Translational Research. 2017; 9(1): 90-102.



 

廠牌: Genpharma   產品:shRNA

shRNA慢病毒載體

1、大大提高對於一些較難轉染的細胞， 如原代細胞、幹細胞、不分化的細胞等轉導效率
2、快速獲得高水平的表達
3、目的基因整合到宿主細胞基因組的機率大大增加
4、將免疫反應降到最低
5、能夠插入大的片段(~7.5 kb)
6、能夠應用於幹細胞研究
7、低的細胞毒性

什麼時候應該使用shRNA慢病毒載體：

1、當你的實驗細胞為原代培養細胞，或難以轉染的各種細胞

2、當你需要製備多種穩定沉默特定基因的細胞株

3、您應該先透過siRNA篩選到有效的的基因沉默靶點，再決定構建慢病毒載體來滿足實驗需求


shRNA慢病毒載體圖譜
Lenti
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